近年二代基因測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)快速發(fā)展，其應(yīng)用已進(jìn)展至臨床檢測(cè)，如遺傳疾病、實(shí)體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細(xì)胞抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。想完成這一系列檢測(cè)分析肯定離不開一間功能完備的實(shí)驗(yàn)室，那么，關(guān)于二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)室裝修都應(yīng)注意什么？

實(shí)驗(yàn)室總體要求

NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的總體設(shè)計(jì)與要求應(yīng)參考《分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室建設(shè)指南（試行）》、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》、《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》、《腫瘤個(gè)體化治療檢測(cè)技術(shù)指南》、《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》、《測(cè)序技術(shù)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)指南（試行）》進(jìn)行。

1、NGS檢測(cè)人員的資質(zhì)要求：NGS檢測(cè)技術(shù)人員應(yīng)具備臨床病理學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)專業(yè)大專以上學(xué)歷，并經(jīng)過(guò)NGS技術(shù)的理論與技能培訓(xùn)合格。數(shù)據(jù)分析人員應(yīng)具有臨床醫(yī)學(xué)或分子生物學(xué)或遺傳學(xué)知識(shí)背景并經(jīng)生物信息學(xué)培訓(xùn)。最終報(bào)告應(yīng)由中級(jí)或碩士以上具有病理學(xué)背景、經(jīng)培訓(xùn)合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權(quán)簽字人(醫(yī)學(xué)博士學(xué)位或高級(jí)職稱)審核。

2、NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的區(qū)域設(shè)置要求：原則上NGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)有以下分區(qū)：樣本前處理區(qū)、試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫(kù)制備區(qū)、雜交捕獲區(qū)/多重PCR區(qū)域（第一擴(kuò)增區(qū)）、文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)（第二擴(kuò)增區(qū)）、文庫(kù)檢測(cè)與質(zhì)控區(qū)、測(cè)序區(qū)、數(shù)據(jù)存貯區(qū)。各工作區(qū)空氣及人員流向需要嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》。分區(qū)可根據(jù)實(shí)際情況合并，但是在前處理和建庫(kù)時(shí)，血液樣本應(yīng)與組織樣本分開。

3、NGS檢測(cè)試劑及項(xiàng)目要求：試劑和測(cè)序平臺(tái)均應(yīng)選擇中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)認(rèn)可產(chǎn)品。涉及到實(shí)驗(yàn)室自配試劑，應(yīng)該有嚴(yán)格的試劑制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），需經(jīng)過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目(LDT)驗(yàn)證合格才可使用。每個(gè)NGS檢測(cè)項(xiàng)目在驗(yàn)證時(shí)需要根據(jù)建庫(kù)方法、測(cè)序平臺(tái)和分析工具以及不同的突變類型包括，單堿基突變single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數(shù)變異Copynumber variations（CNVs）、染色體結(jié)構(gòu)變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）對(duì)特定panel的準(zhǔn)確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數(shù)進(jìn)行LDT驗(yàn)證。應(yīng)該有經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的在不同的mutant allele frequencies（MAF）下，不同測(cè)序深度的靈敏度及特異性數(shù)據(jù)，確定不同樣本的可信的測(cè)序深度。經(jīng)驗(yàn)證后，SOP發(fā)生的任何改動(dòng)，包括試劑、儀器、基因項(xiàng)目等都需要重新做驗(yàn)證。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果簽名留底備案。

4、NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理要求：NGS檢測(cè)主要包括實(shí)驗(yàn)操作和生物信息

學(xué)分析兩部分。實(shí)驗(yàn)操作部分包括樣本準(zhǔn)備、文庫(kù)制備、編碼（barcoding）、目標(biāo)區(qū)域富集、測(cè)序等；生物信息學(xué)分析部分包括定位（mapping）、比對(duì)、變異識(shí)別、變異注釋、變異解讀及報(bào)告等。上述流程均需要建立實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系文件和SOP及機(jī)器運(yùn)行和維護(hù)SOP，具有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控措施；定期參加室間質(zhì)評(píng)以有及持續(xù)的質(zhì)量保證和改進(jìn)計(jì)劃。

NGS分析樣本、基因panel和轉(zhuǎn)運(yùn)要求

NGS分析樣本類型可采用FFPE樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細(xì)胞塊石蠟包埋標(biāo)本和血漿/血液標(biāo)本等。

對(duì)于腫瘤體細(xì)胞變異初次NGS檢測(cè)應(yīng)首選經(jīng)病理評(píng)估的組織樣本，在此數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的再次檢測(cè)可選取液體樣本動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

NGS檢測(cè)前需通過(guò)病理診斷明確其腫瘤的性質(zhì)及含量，根據(jù)不同腫瘤類型選擇合適的基因panel測(cè)序。

不同疾病的基因panel列表，必須由臨床與檢測(cè)機(jī)構(gòu)的專家共同決定，已達(dá)到不同實(shí)驗(yàn)室之間的可比性和完善性。

未經(jīng)病理評(píng)估的基因檢測(cè)結(jié)果不可單獨(dú)用于分子病理臨床診斷目的。

樣本質(zhì)量對(duì)檢測(cè)結(jié)果和分析至關(guān)重要，病理醫(yī)師需要對(duì)可評(píng)估的樣本進(jìn)一步明確病理診斷，并評(píng)價(jià)標(biāo)本有無(wú)出血、壞死和不利于核酸檢測(cè)的前處理（例如含HCl脫鈣液處理），病變細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量建議達(dá)到20%以上，低于此標(biāo)準(zhǔn)可富集后檢測(cè)。

NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)不同類型的樣本有采集及處理SOP指導(dǎo)。對(duì)于不同的樣本（FFPE、體液、血液等）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有不同的樣本運(yùn)送SOP，物流環(huán)節(jié)（含冷鏈運(yùn)輸）應(yīng)有相關(guān)運(yùn)送記錄，確保樣本運(yùn)送安全、無(wú)污染、無(wú)降解。

NGS檢測(cè)流程中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1、核酸提取及其質(zhì)量分析：提取的核酸質(zhì)量是NGS檢測(cè)成功的關(guān)鍵因素，在制備文庫(kù)前應(yīng)采用多種方法對(duì)核酸質(zhì)量評(píng)估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據(jù)不同的樣本類型制定相應(yīng)的SOP用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對(duì)應(yīng)明確接受和拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。

2、文庫(kù)制備及其質(zhì)量分析：文庫(kù)制備方法主要有雜交捕獲和擴(kuò)增子建庫(kù)，無(wú)論采用何種方法制備文庫(kù)和平臺(tái)檢測(cè)，都應(yīng)對(duì)檢測(cè)基因、區(qū)域或突變熱點(diǎn)進(jìn)行描述，并建立實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SOP。建立好文庫(kù)后上機(jī)測(cè)序前需對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量分析。每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)設(shè)定其文庫(kù)質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。

3、NGS測(cè)序儀上機(jī)分析及其質(zhì)量分析：NGS建庫(kù)主要有擴(kuò)增法和捕獲法兩大策略，測(cè)序時(shí)根據(jù)檢測(cè)樣本量和質(zhì)量要求確定適當(dāng)?shù)男酒?，以保證測(cè)序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。錄入樣本編號(hào)、檢測(cè)內(nèi)容、設(shè)定參數(shù)等信息，按儀器操作流程進(jìn)行測(cè)序。產(chǎn)生的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)要求詳見(jiàn)后文。

4、NGS檢測(cè)中的樣本追蹤及對(duì)照設(shè)置：（1）樣本追蹤：為確保檢測(cè)過(guò)程中樣本沒(méi)有混淆或污染，可選用多個(gè)SNV位點(diǎn)或其他標(biāo)簽作為樣本身份標(biāo)識(shí)（sample ID），在檢測(cè)前對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行SNV位點(diǎn)信息的測(cè)定，在NGS檢測(cè)后對(duì)上述位點(diǎn)進(jìn)行追蹤，證明沒(méi)有交叉污染。（2）陽(yáng)性對(duì)照：應(yīng)用組合型質(zhì)控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復(fù)雜性。實(shí)驗(yàn)時(shí)同時(shí)檢測(cè)，以確保其檢出能力。（3）陰性對(duì)照：用無(wú)核酸或明確無(wú)突變的樣本作為模板同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，以確保檢測(cè)過(guò)程中沒(méi)有污染或非特異性。（4）應(yīng)對(duì)方案和替代方法：各個(gè)質(zhì)量控制步驟中如出現(xiàn)異?；蚴。瑢?shí)驗(yàn)室應(yīng)有應(yīng)對(duì)措施或備選方案；對(duì)于測(cè)序結(jié)果質(zhì)量差或有問(wèn)題的區(qū)域應(yīng)建立替代方法（如Sanger測(cè)序）。

德瑞普作為上海知名EPC工程總包二測(cè)序?qū)嶒?yàn)室裝修企業(yè)，已為眾多公司設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)室裝修方案，贏得如潮好評(píng)。擁有專注空間設(shè)計(jì)12年的一線設(shè)計(jì)師，專注實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)工程建設(shè)的團(tuán)隊(duì)體系，擁有國(guó)家建筑施工總承包三級(jí)、實(shí)驗(yàn)室裝飾裝修設(shè)計(jì)乙級(jí)、工程裝飾裝修二級(jí)、消防設(shè)施二級(jí)、電子智能化二級(jí)、機(jī)電安裝工程三級(jí)、鋼結(jié)構(gòu)工程三級(jí)等專業(yè)資質(zhì)，致力于為客戶提供一站式的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)解決方案。